普歇仍然不服，他认为巴斯德说的空气中附着于尘埃之上的微生物根本 不存在。巴斯德认为普歇的反驳是有道理的，怎样证明反流入瓶中的空气中 一定有微生物呢？巴斯德决定继续实验。

1860年9月10日，巴斯德做了几百个圆肚烧瓶，瓶中不用烧沸的肉汤， 只用消过毒的肉汤。巴斯德将烧瓶放在水中煮沸几分钟，把瓶中的空气赶出 去。同时用火焰烧熔瓶颈，拉成细长的小管并封住管口。如果折断小管，外 界的空气就会带着尘埃进入瓶内，再把管口封住，放在温箱中培养。

巴斯德想，如果真是空气中会自然发生微生物的话，那么，不论什么地 方的空气都应该是一样的。巴斯德把许多瓶肉汤分别放在空气很少流动的巴 黎天文台地下室和空气流动的院子里，小心地把瓶子的颈口夹破，让空气进 入瓶内，然后再用火封死。培养的结果表明：在地下室收集的10瓶，除一瓶 稍有混浊外，全都透亮澄清，没有微生物生长；在院子里收集的11瓶，都变 得混浊，都有微生物生长。